تولید آنتی بادی مونوکلونال بر ضد گلیکوپروتئین erns و پروتئین ns3 نوترکیب ویروس اسهال ویروسی گاوان (سویه nadl)

اسهال ویروسی گاوان (bvd) با یک انتشار جهانی، یکی از بیماری های مهم اقتصادی در گاو می باشد. ویروس اسهال ویروسی گاوان (bvdv) متعلق به خانواده فلاوی ویریده و جنس پستی ویروس، یکی از مهمترین پاتوژن های ویروسی گاو است که باعث بروز سندرم های بالینی مختلفی می شود. دام های مبتلا به شکل عفونت پایدار با ویروس اسهال ویروسی گاوان، به عنوان منبع اصلی حفظ و انتشار ویروس بین گله ها محسوب می شوند، بنابراین تعیین و حذف حیوانات دارای عفونت پایدار در کنترل این بیماری و ریشه کنی ویروس ضروری است. معمولا علائم کلینیکی مشخصی در عفونت با ویروس bvd وجود ندارد، بنابراین تشخیص آن بر پایه روش های سرولوژی و جداسازی ویروس می باشد. از نظر ژنتیکی و آنتی ژنی، erns (گلیکوپروتئین 48) و ns3 (پروتئین غیر ساختمانی 3) به عنوان پروتئین های ایمنی زای ویروس bvd، بین جدایه های مختلف ویروس محافظت شده می باشند. بنابراین این پروتئین ها در طراحی الیزا به منظور مطالعات سرولوژیکی یا شناسایی حیوانات pi، به عنوان یک آنتی ژن انتخابی هستند. هدف از این مطالعه تولید آنتی بادی مونوکلونال ضد پروتئین های نوترکیب ernsو ns3 بود. بدین منظور یک قطعه از ژنوم ویروس bvd(سویه nadl) که مسئول کد کردن سکانس erns بود، با استفاده از rt-pcr تکثیر و در ناقل بیانی pmalc2x تحت کنترل پروموتور lac کلون گردید. بعد از تعیین توالی ژن، پروتئین نوترکیب در باکتری اشریشیا کلیbl-21 بیان و به وسیله sds-page و وسترن بلات آنالیز گردید. پروموتور قدرتمند ناقل pmalc2x، امکان بیان بالای پروتئین نوترکیب mbp-erns را فراهم نمود. پروتئین نوترکیب mbp-ns3 نیز به طور همزمان در آزمایشگاه تولید گردید. پروتئین های نوترکیب mbp-erns و mbp-ns3 بیان شده در اشرشیا کلی با کمک ستون کروماتوگرافی رزین آمیلوز خالص و به عنوان آنتی ژن برای تولید آنتی بادی مونوکلونال استفاده شدند. پس از ایمن سازی موش های balb/c با آنتی ژن های نوترکیب، موشی که با استفاده از الیزای غیر مستقیم بیشترین عیار آنتی بادی ضد erns یا ns3را نشان داد برای استحصال طحال و فیوژن انتخاب گردید. سلول های طحالی موش های ایمن توسط پلی اتیلن گلیکول (peg) با سلول های میلوما sp2/0ادغام شدند. مخلوط سلولی فیوژن یافته در محیط hat وارد و در پلیت 96 خانه تقسیم گردیدند. سپس مایع رویی کلون های اولیه توسط الیزای غیر مستقیم غربالگری شدند. کلون های مثبت بعد از 3 بار کلونینگ، انتخاب و واکنش پذیری آنتی بادی های مونوکلونال با آنتی ژن های نوترکیب و طبیعی از طریق وسترن بلاتینگ تایید شدند. بر اساس این نتایج به نظر می رسد آنتی ژن های نوترکیب erns و ns3 و آنتی بادی های اختصاصی تولید شده بر ضد آن ها، به منظور طراحی روش های تشخیصی آزمایشگاهی مفید باشند.